تولید انگلهای نوترکیب لیشمانیا تروپیکا بیان کننده دو پروتئین گزارشگرEGFP و لوسیفراز

سابقه و هدف: انگل لیشمانیا تروپیکا عامل بروز لیشمانیوز پوستی و احشایی در ایران است. بعلت فقدان یک آزمون دقیق، حساس و غیرتهاجمی در مدل حیوانی، درمان و واکسیناسیون برعلیه آن با چالش بزرگی همراه است. لذا در این مطالعه، لیشمانیا تروپیکا با دو ژن گزارشگر پروتئین فلورسنت سبز (egfp) و لوسیفراز (luc) به شکل اتصال یافته (egfp-luc) ترانسفکت شد تا در مطالعات آتی بعنوان یک ابزار تشخیصی سریع و دقیق برای ردیابی و اندازه گیری میزان عفونت در بدن حیوان زنده مورد استفاده قرار گیرد. مواد و روش­ها: در این مطالعه آزمایشی-تجربی، سازه ژنی حاوی ژنهای egfp-luc از طریق نوترکیبی مشابه در ژنوم سویه ایرانی انگل لیشمانیا تروپیکا (در لوکوس 18srRNA) درج شد. برای غربالگری انگلهای ترانسفکت شده، از شاخص انتخابی G418 استفاده گردید. سپس بوسیله PCR با پرایمرهای مختلف ژنوتیپ انگلها بررسی شد. همچنین با استفاده از وسترن بلات، میکروسکوپ فلورسنت و فلوسایتومتری بیان پروتئینهای گزارشگر ارزیابی شد. یافته ­ها: مشاهدات اولیه فنوتیپی انگل با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت نشان داد که انگلهای نوترکیب L. tropicaEGFP-LUC پروتئین EGFP را در سیتوپلاسم تولید کرده اند. میزان کمی شدت فلورسنت اندازه گیری شده در انگلهای نوترکیب با استفاده از فلوسایتومتری بیش از 90% بود. نتایج آزمونهای PCR ورود ژنها را بدرون ژنوم و لوکوس مربوطه و وسترن بلات بیان هر دو ژن را در شکل پروماستیگوت انگل نشان دادند. نتیجه­ گیری: این اولین گزارش مبنی بر تولید انگلهای نوترکیب لیشمانیا تروپیکا بیان کننده هر دو ژن گزارشگرegfp  و luc بطور همزمان است.